生物分离为什么比化工分离难

㈠ 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有什么特点

2.1 概述 ? 在自然科学,尤其是生命科学高度发展的今天,蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题,而生物大分子结构与功能的研究,必须首先解决生物大分子的制备问题,有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题,结构与功能的研究就无从谈起.然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作. ? 与化学产品的分离制备相比较,生物大分子的制备有以下主要特点： ? ⑴生物材料的组成极其复杂,常常包含有数百种乃至几千种化合物. ? ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长. ? ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活,因此分离过程中如何防止其失活,就是生物大分子提取制备最困难之处. ? ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断. ? 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ? ①确定要制备的生物大分子的目的和要求,是进行科研、开发还是要发现新的物质. ? ②建立相应的可靠的分析测定方法,这是制备生物大分子的关键. ? ③通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子目的产物的物理化学性质. ? ④生物材料的破碎和预处理. ? ⑤分离纯化方案的选择和探索,这是最困难的过程. ? ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定,要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰. ? ⑦产物的浓缩,干燥和保存. ? ? 分析测定的方法主要有两类： ? 即生物学和物理、化学的测定方法. ? 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； ? 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等. ? 实际操作中尽可能多用仪器分析方法,以使分析测定更加快速、简便. 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： ? ①在水和各种有机溶剂中的溶解性. ? ②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性. ? ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性. ? ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数. ? ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性. ? ⑥对其他生物分子的特殊亲和力. ? 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样,主要是利用它们之间特异性的差异,如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等. ? 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： ? ①利用混合物中几个组分分配系数的差异,把它们分配到两个或几个相中,如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； ? ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中,通过物理力场的作用,使各组分分配于不同的区域,从而达到分离的目的,如电泳、离心、超滤等. ? 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心. ? 2.2 生物大分子制备的前处理 ? 2.2.1 生物材料的选择 ? 制备生物大分子,首先要选择适当的生物材料.材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物. ? 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低,尽可能保持新鲜,尽快加工处理. ? 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分,绞碎后在适当的溶剂中提取,如果所要求的成分在细胞内,则要先破碎细胞. ? 植物要先去壳、除脂. ? 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开. ? 生物材料如暂不提取,应冰冻保存.动物材料则需深度冷冻保存. ? 2.2.2 细胞的破碎 ? 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同,如动物脏器的细胞膜较脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁,要采取专门的细胞破碎方法. ? (1)机械法： ? 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆. ? 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法,通常可先用家用食品加工机将组织打碎,然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎. ? (2)物理法： ? 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,如此反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎. ? 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器.破碎微生物细菌和酵母菌时,时间要长一些. ? 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法.在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎. ? 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法.在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎. ? (3)化学与生物化学方法： ? 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下,细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出来. ? 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物. ? 3) 酶解法：利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等,于37℃,pH8,处理15分钟,可以专一性地将细胞壁分解. ? 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞,可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与研磨法联合使用. ? ? 2.2.3 生物大分子的提取 ? “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中,使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中,并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程. ? 影响提取的因素主要有： ? 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； ? 由固相扩散到液相的难易； ? 溶剂的pH值和提取时间等. ? 通常： ? 极性物质易溶于极性溶剂,非极性物质易溶于非极性溶剂； ? 碱性物质易溶于酸性溶剂,酸性物质易溶于碱性溶剂； ? 温度升高,溶解度加大； ? 远离等电点的pH值,溶解度增加. ? 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性. ? ⑴ 水溶液提取： ? 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主.稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好,溶解度大,是提取蛋白质和酶最常用的溶剂.用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是： ? 1) 盐浓度（即离子强度）： ? 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响,有些物质,如DNA-蛋白复合物,在高离子强度下溶解度增加. ? 绝大多数蛋白质和酶,在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度,如在纯水中加入少量中性盐,蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加,称为“盐溶”现象.盐溶现象的产生主要是少量离子的活动,减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力,增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果. ? 为了提高提取效率,有时需要降低或提高溶剂的极性.向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低,增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性. ? ? 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关.过酸、过碱均应尽量避免,一般控制在pH=6～8范围内,提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内,通常选择偏离等电点的两侧. ? 3) 温度：为防止变性和降解,制备具有活性的蛋白质和酶,提取时一般在0℃～5℃的低温操作. ? 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性,防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用. ? 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活.因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基,有些巯基常常是活性部位的必需基团,若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键,导致酶活性的丧失.在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化. ? ⑵ 有机溶剂提取 ? 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中,常用不同比例的有机溶剂提取. ? 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有亲水性和亲脂性. ? 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱,又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中,在这种情况下,采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏,并兼有除去杂质提高纯化效果的作用. 例如,胰岛素（见讲义p36）. ? 2.3 生物大分子的分离纯化 ? 由于生物体的组成成分是如此复杂,数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中,因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序,但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的. ? 为了避免盲目性,节省实验探索时间,要认真参考和借鉴前人的经验,少走弯路.常用的分离纯化方法和技术有： ? 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等.本章以介绍沉淀法为主. ? 2.3.1 沉淀法 ? 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程.沉淀法（即溶解度法）操作简便,成本低廉,不仅用于实验室中,也用于某些生产目的的制备过程,是分离纯化生物大分子,特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法.通过沉淀,将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相,而与杂质得到初步的分离. ? 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的,不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的,溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关,溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变. ? 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ? ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化. ? ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化. ? ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白. ? ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀,但此法单独应用较少,多与其他方法结合使用. ? ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法, 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂. ? 2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法） ? 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”.除了蛋白质和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离. ? 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域,已有八十多年的历史,其突出的优点是： ? ①成本低,不需要特别昂贵的设备. ? ②操作简单、安全. ? ③对许多生物活性物质具有稳定作用. ? ⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理 ? 蛋白质和酶均易溶于水,因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,因而溶解度也越大.亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜.因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露出疏水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子即形成沉淀.盐析示意图如下页“图 4”所示. ? ⑵ 中性盐的选择 ? 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4,因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： ? 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的.由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行.由下表可以看到, 硫铵在0℃时的溶解度,远远高于其它盐类： ? 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） ? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 ? Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 ? NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ? ? ? ? ? 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析,一步就可以除去75％的杂蛋白,纯 度提高了四倍. ? 3) 不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的 作用.有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久. ? 4) 价格便宜,废液不污染环境. ? ⑶ 盐析的操作方法 ? 最常用的是固体硫酸铵加入法.将其研成细粉,在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入,接近计划饱和度时,加盐的速度更要慢一些,尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀.盐析后要在冰浴中放置一段时间,待沉淀完全后再离心与过滤. ? 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离,高浓度硫酸铵常用过滤方法. ? 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出. ? ⑷ 盐析曲线的制作 ? 如果要分离一种新的蛋白质和酶,没有文献数据可以借鉴,则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度.具体操作方法如下(讲义p39)： 蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱 和度％ ? ⑸盐析的影响因素 ? 1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀,若蛋白质浓度过高,易产生各种蛋白质的共沉淀作用.低浓度的蛋白质,共沉淀作用小,但回收率降低.较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％,相当于25 mg/mL～30mg/mL. ? 2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小,pH值常选在该蛋白质的等电点附近. ? 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子,在高离子强度溶液中,温度升高,它们的溶解度反而减小.在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的.一般情况下,可在室温下进行.但对于某些对温度敏感的酶,要求在0℃～4℃下操作,以避免活力丧失. ? ? 2.3.1.2 有机溶剂沉淀法 ? ⑴基本原理 ? 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用,是较早使用的沉淀方法之一.其原理主要是： ? ①降低水溶液的介电常数,向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数,减小溶剂的极性,从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力,导致蛋白质溶解度降低而沉淀. ? ②由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子,破坏了蛋白质分子的水膜,因而发生沉淀作用. ? ? 有机溶剂沉淀法的优点是： ? ①分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀. ? ②沉淀不用脱盐,过滤比较容易（如有必要,可用透析袋脱有机溶剂）.因而在生化制备中有广泛的应用. ? 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作需在低温下进行. ? ⑵有机溶剂的选择和浓度的计算 ? 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶.沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮. ? 为了获得沉淀而不着重于进行分离,可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂,来进行有机溶剂沉淀. ? ⑶有机溶剂沉淀的影响因素 ? 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感,温度稍高就会引起变性,且有机溶剂与水混合时产生放热反应,因此必须预冷,操作要在冰盐浴中进行,加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓. ? 一般规律是温度越低,得到的蛋白质活性越高. ? 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低,要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀.高浓度样品,可以节省有机溶剂,减少变性的危险,但杂蛋白的共沉淀作用大. ? 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜. ? ? 3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内,通常是选在等电点附近,从而提高此沉淀法的分辨能力. ? 4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响,通常盐浓度以不超过5％为宜,使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜,少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用,但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度,降低了沉淀效果,通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质. ? 沉淀所得的固体样品,如果不是立即溶解进行下一步的分离,则应尽可能抽干沉淀,减少其中有机溶剂的含量,如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂,以免影响样品的生物活性. ? 2.3.1.3 选择性变性沉淀法 ? 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异,选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯. ? ⑴ 热变性 ? 利用生物大分子对热的稳定性不同,加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中. ? ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性 ? 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀.通常在冰浴或冷室中进行. ? ⑶ 选择性酸碱变性 ? 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀.通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤. ? 2.3.1.4 等电点沉淀法 ? 利用具有不同等电点的两性电解质,在达到电中性时溶解度最低,易发生沉淀,从而实现分离的方法.氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质,可以利用此法进行初步的沉淀分离. ? 由于许多蛋白质的等电点十分接近,而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度,不能完全沉淀析出,因此,单独使用此法分辨率较低,因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用,以提高沉淀能力和分离效果. ? 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白,而不用于沉淀目的物. ? 2.3.1.5 有机聚合物沉淀法 ? 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂,最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒.近年来广泛用于核酸和酶的纯化.其中应用最多的是 “聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 简写为 PEG ),它的亲水性强,溶干水和许多有机溶剂,对热稳定,有广泛围的分子量,在生物大分子制备中,用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG. ? 本方法的优点是： ? ①操作条件温和,不易引起生物大分子变性. ? ②沉淀效能高,使用很少量的P“EG即可以沉淀相当多 的生物大分子. ? ③沉淀后有机聚合物容易去除. ? 2.3.2 透析 ? 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年.透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一.在生物大分子的制备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术. ? 透析只需要使用专用的半透膜即可完成.保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”.截留分子量MwCO通常为1万左右. ? 用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4,用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等. ? 2.3.3 超滤 ? 超过滤即超滤,自20年代问世后,直至60年代以来发展迅速,很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术.超滤现已成为一种重要的生化实验技术,广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化. ? 超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化. ? 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同,可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种. ? 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa,膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃）,用于分离较大的微粒、细菌和污染物等. ? 超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa,膜的平均孔径为10—100埃,用于分离大分子溶质. ? 反渗透所用的操作压比超滤更大,常达到35×105Pa～140×105Pa,膜的平均孔径最小,一般为10埃以下,用于分离小分子溶质,如海水脱盐,制高纯水等. ? 超滤技术的优点是操作简便,成本低廉,不需增加任何化学试剂,尤其是超滤技术的实验条件温和,与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化,而且不引起温度、pH的变化,因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶. ? 在生物大分子的制备技术中,超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等. ? 超滤法也有一定的局限性,它不能直接得到干粉制剂.对于蛋白质溶液,一般只能得到10～50％的浓度. ? 超滤技术的关键是膜. ? 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成.近年来发展了非纤维型的各向异性膜,例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等.这种膜在pH 1～14都是稳定的,且能在90℃下正常工作.超滤膜通常是比较稳定的,能连续用1～2年. ? 超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等. ? 超滤装置由若干超滤组件构成.分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型. ? 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等.这些物质极易粘附和沉积于膜表面上,造成严重的浓差极化和堵塞,这是超滤法最关键的问题,要克服浓差极化,通常可加大液体流量,加强湍流和加强搅拌. ? 2.3.4 冰冻干燥 ? 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一,因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液,要从水溶液中得到固体产品,最好的办法就是冰冻干燥

㈡ 生物1:2:1性状分离比是什么情况

在中学阶段的话，通常是一对等位基因杂合子交配后代，显隐性呈不完全显性（即显性纯合与杂合子表现型不同）关系时出现的比例。如亲本基因型都是Aa，后代基因型及比例是AA:Aa:aa=1:2:1，表现型之比也是1:2:1。

㈢ 什么是生物分离与化学分离相比有何特点

生物分离的基本概念
生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。
生物分离过程的主要特点
n
常无固定操作方法可循
生物材料组成非常复杂
n
分离操作步骤多，不易获得高收率
培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高
n
分离进程必须保护化合物的生理活性
生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏
n
基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。
生物分离的一般工艺流程
发酵液→预处理→细胞分离→（
细胞破碎→细胞碎片分离
）
↙
→初步纯化→高度纯化→成品加工
注：（1）胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化。
（2）在初步纯化及其以前的各步操作，处理的体积较大，着重于浓缩，称为提取或分离；以后各步为精细的分离操作，着重于纯化，称为精制（或纯化）。
生物分离的各阶段的常用方法
（1）发酵液的预处理
n
加热
n
调pH
n
絮凝和凝聚
（2
）固液分离
n
沉降
n
离心分离
n
过滤
n
错流过滤
（3）细胞破碎
n
机械法
高压匀浆、高速珠磨、
超声波破碎
n
非机械法
化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法
（4
）初步纯化
n
沉淀法
n
吸附法
n
萃取法
n
超滤法
（5）高度纯化
n
层析
亲和层析、凝胶层析、离子交换层析
n
电泳
n
结晶和重结晶
（6
）成品加工
n
无菌过滤
n
去热原
n
干燥
冷冻干燥、喷雾干燥
n
制剂
生物分离方法的选择依据
n
传统生物药物（抗生素）
根据具体条件，通过小实验决定，选择时应考虑两个因素。
（1）抗生素的理化性质：极性、酸碱性、溶解度等，了解其理化性质，通常利用纸层析和纸电泳的方法。
（2）抗生素的稳定性：要了解它在什么样的pH和温度范围易受破坏。
纸层析
抗生素在某一种溶剂中的Rf值大，表明它在该种溶剂中溶解度大；相反，如Rf值小，则溶解度小。如Rf为零，则说明不能溶解。如抗生素在极性强的溶剂中有较大的Rf值，则表明该抗生素是极性化合物；而非极性抗生素在非极性溶剂中Rf值较大，在极性溶剂中Rf值较小。
纸电泳
通过纸层析判断为水溶性的抗生素，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。
电泳结果与样品性质的判断见课本第六页表1-1。
生物分离方法的选择依据
n
基因工程药物
应根据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物化学方面性质的差异，如，生物特异性、分子量、等电点值和稳定性等。当几种方法联用时，最好以不同的分离机理为基础，且前一种方法处理过的液体应能适于后一种方法的料液。

㈣ 生物分离工程与化学分离工程的区别和特点

生物分离工程与化学分离工程的区别和特点
生物分离工程定义

是生物化学工程的一个重要组成部分，它是描述回收生物产品分离过程原理和方法的一个术语，指从发酵液或酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。

2.生物产品定义

生物产品是指在生产过程的某一阶段，应用生化反应制得的产品。它包括传统的（常规的）生物技术产品（如用发酵生产的有机溶剂，氨基酸，有机酸，抗生素）和现代生物技术产品（如用重组DNA技术生产的医疗性多肽和蛋白质）。

3.下游加工选择准则

（1）采用步骤数量少；（2）采用步骤的次序要相对合理；（3）产品的规格；（4）产品的生产规模；（5）进料组成；（6）产品的形式、稳定性、物性；（7）危害性，废水；（8）分批或连续过程，

第二章

1.预处理常见方法

预处理的目的：改变发酵液的物理性质促进固液分离，有利于产物的回收，并能够去除发酵液中的杂质；

方法：1)加热;最简单、最经济的预处理方法是加热，加热不仅可以增加料液的操作特性，也可以对其进行灭菌。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。

2)调节pH;

3)凝聚和絮凝;通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝，试剂有简单的电解质、酸、碱、合成的聚合电解质。

4)助滤剂上的吸附;

这些方法也适用于对于离心和沉淀过程。

2.凝聚与絮凝的比较

1）凝聚： 简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。 凝聚值：使胶粒发生凝集作用的最小电解质浓度（mmol/L）。

反离子的价数越高，凝聚值就越小。A13+＞Fe3+＞H+……常用的有明矾（硫酸铝）、石灰、硫酸亚铁、三氯化铁等

2）絮凝：预处理时加入合成聚合电解质既能降低排斥电位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶粒形成粗大，密度低的絮凝团。这些絮凝团很容易被过滤得到。

3.过滤操作计算

见书本P20

4.助滤剂定义

助滤剂是一种颗粒均匀，质地坚硬、不可压缩的颗粒物质，过滤时能够防止介质堵塞。 1）硅藻土：硅藻土是百年前水生植物沉淀下来的遗骸。 2）珍珠岩 ：珍珠岩是处理过的膨胀火山岩。

㈤ 为什么说分离技术水平严重影响到食品，药品和发酵生物产品的品质和效益

食品工业中用发酵和煮制的话，常常用离心技术。此外层析和膜分离也很常用。下面介绍下生物分离技术和生物技术在食品工业中的应用进展。生物分离技术最常见的分离纯化方法包括盐析和有机溶剂分级沉淀、超滤技术、层析技术、电泳技术、离心技术。 (1)盐析或有机溶剂分级沉淀：向反应产物溶液中加入大量易溶解的盐如氯化钠、硫酸铵，这些盐的离子能结合大量的水，产物因此被盐沉淀出来。产物溶液中加入能和水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮，常常能降低产物溶解度，而使产物沉淀。选择适当条件可使产物和杂质分开。 (2) 超滤技术：选择适当孔径的超滤膜或超滤中空纤维柱，通过抽滤加压使一定大小的分子能水一起穿过孔径，更大的分子则被挡住，以此将产物分离出来。 (3)层析技术：使用滤纸、纤维素、树脂、凝胶颗粒、多空玻璃珠等填充支持物或者不同于溶剂的另一种液相作为固定的介质对溶剂中的不同物质的结合力不一样，当溶剂向前推进时，溶剂中的不同溶质便可彼此分开。此外还有按分子大小分开的分子筛层析，按解离能力和离子性质分开的离子交换层析，按生物分子间亲和力大小分开的亲和层析，以及按两相溶液间分配系数差异而分开的逆流分溶。 (4)电泳技术：带有电荷的离子或颗粒在电场作用下向一个电击方向移动，离子或颗粒因其所带电荷和质量的不同，在电场中的移动速度不同，因而彼此被分开。被广泛使用的是凝胶电泳，而毛细管电泳具有最灵敏的分析效果。 (5)细胞、细胞碎片和生物大分子在离心力场作用下能被沉淀下来。离心机在每分钟旋转10000次以下的低速是就能使细胞沉淀，细胞碎片要在每分钟旋转20000到30000次的高速下才能被沉降，生物大分子则需要在每分钟旋转30000次以上的超速离心方能克服分子热运动而被沉降。生物技术在食品工业中的应用进展益生菌：随着益生菌多项保健功能的不断发现，如平衡肠道菌群，改善肠道功能、调节免疫、增强消化功能，促进营养物质吸收、抗诱变和防癌特性、抗氧化与延缓衰老以及改善心血管系统等。目前，国际上对益生菌的研究显得非常活跃，特别是在日本、法国、美国等国家已形成了系统化专业性科研队伍。世界各国益生畅甫扳晃殖浩帮彤爆廓菌研究主要集中在益生菌促进人体健康的机理、益生菌的工业化与产业化应用技术、更高质量或带多功能性益生菌的高效筛选与定向设计等前沿领域，其研究成果应用于食品工业生产大大提高了人体健康水平并带来了客观的经济效益。在我国，特别是在奶制品和一些功能性的食品中益生菌已广为运用。在基础研究方面，我国科学家取得了丰硕的研究成果。2008年7月，内蒙古农业大学等单位承担的益生菌L．casei Zhang基因组学和蛋白质组学研究项目通过鉴定，项目完成了益生菌L．ca-sei Zhang染色体基因组和质粒基因组plca36序列的测定，从而能够准确地将该菌株的益生功能基因进行定位，为其益生机理进一步深入研究和相关产品的开发应用从基因水平上奠定了基础。该项目的完成标志着我国在乳酸菌基因组学方面的研究达到国际水平。同时，国内围绕乳制品、发酵肉制品工业发酵剂菌株筛选获得重要进展，建立了从多菌相肉品发酵体系中定向筛选特质菌株的高通量技术平台和我国第一个原创性、具有自主知识产权的乳酸菌菌种资源库，筛选得到了几十株具有优良生产性状及益生特性的乳酸菌菌株，为我国益生菌制品的开发奠定了强大的技术和菌源基础。代谢工程：在代谢工程研究方面，随着研究应用的深入，代谢工程的定义也在不断更新，现在多将其定义为利用基因工程技术，有目的地对细胞代谢途径进行精确地修饰、改造或扩展、构建新的代谢途径，以改变微生物原有代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，提高目的代谢产物活性或产量，合成新的代谢产物的工程技术科学。总体而言，代谢工程是在建立代谢网络理论的基础上，通过对代谢流的定性、定量分析，从而对代谢工程进行设计包括改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径等方法，其核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作，所以又称为第三代基因工程。代谢工程主要包括3个步骤：细胞途径的修饰(合成)，修饰后细胞表型的严格评价(表型表征)，根据评价结果设计进一步的修饰(优化设计)。其中，表现表征的评价即是在获得大量生化反应数据的基础上，采用化学、数学的研究方法并结合先进的信息技术进行高通量分析，进一步研究细胞代谢的动态特征和控制机理，并由此发展了各种数学系统模型用于辅助改善代谢工程设计。随着后基因组学时代的到来，各种组学技术(基因组学、转录物组学、蛋白质组学、代谢物组学、代谢通量组学等)在代谢工程相关研究中被广泛使用，通过组学技术对细胞基因组以及细胞与微观和宏观环境条件关系等特性进行表型表征，代替传统表型表征的方法，使代谢工程的研究从局部通路水平上升到整体水平，从而可以更好地揭示生物复杂代谢网络及调控机理，进行代谢工程的研究。目前，以各层次功能基因组学研究为基础，借助高通量实验技术和生物信息学工具等，通过整合各层次组学研究数据，建立数学模型，或通过比较不同菌株或同一菌株在不同条件下各个层次组学差异以阐明生命活动规律，以此进行代谢工程设计的尺度多层次的系统生物学方法，成为了各国科学家研究的重点方向。生物反应器：在生物反应器研究方面，自动化、多功能和高效率的新型生物反应器一直是近年来研究的热点。包括人工生物反应器和天然生物反应器，比如微生物、动物和植物表达系统等，研究主要集中在将分离技术和生物反应过程结合开发出高效率的生物反应器，比如超临界反应器和膜反应器等，以及研究生物反应机理、反应过程参数传感器的研制、自动化控制系统和数学模型的建立等，特别是参数控制方面的研究和固体发酵生物反应器的开发是研究的两个重点领域。安全检测：此外，生物技术，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和DNA芯片技术等用于食品微生物、毒素以及残留药物等食品安全检测方面也显示出其灵敏度高、特异性强、简便快捷等优势，逐渐成为食品安全研究的重要方向。

㈥ 生物：性状分离比为什么是3:1

Aa自交 后代是AA Aa Aa aa 三个显性性状 一个隐形 所以三比一 谢谢采纳

㈦ 本人是985大学生物专业的学生，今年大3了，考研打算考生物分离工程或者生物化工

作为你的学长，我得问你一下，你将来是打算蹲在实验室还是去企业？如果打算蹲在实验室，建议选分离工程，如果打算去企业，选后者，我是生物技术的，不过我跨专业去学了经济学，说真的，咱们这个专业比较枯燥无聊，我同学现在大部分都在化工企业实验室。建议你考虑好，我是呆不住实验室，所以转了专业！不过选择选择生物了，工资和工作环境比较稳定，如果考的话，建议考中科院生物所吧，感觉不是很难！

㈧ 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同

生物产品较普通化工产品成分复杂、目标产物浓度低、收率低、易失活、不稳定，分离所占成本较高，尤其是一些生物活性产品，分离成本可以占到占整个生产费用的80%-90%。

不过更多的生物产品是非活性产品活性产品并不多

一般的处理技术有：

回收技术:絮凝，离心，过滤，微过滤。

细胞破碎技术:球磨，高压匀浆，化学破碎技术

初步纯化技术:沉淀，离子交换，萃取，膜分离技术，盐析法，有机溶剂沉淀

高度纯化技术:离子交换，结晶，重结晶，各类层析如：亲和，疏水，聚焦，离子交换，凝胶等

成品加工喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶

还要注意时间短、温度低、PH适中、清洁卫生、防止菌体扩散

一般过程如下：

㈨ 高中生物遗传中 分离比 和 性状分离 中的“分离”有什么区别

分离比是不同性状之间的比例,比如一对相对性状的杂合子自交后代的性状分离比为3：1。

而性状分离 中的“分离”是指子一代中出现中显性性状与隐性性状，比如一对相对性状的杂合子自交后代的出现了两种性状。就是发生了分离。像课本上的高茎豌豆自交后代出现了高茎和矮茎两种性状。

㈩ 什么是生物上的分离比

一般来讲就是性状分离比。
比如Aa和Aa交配，后代显性：隐形=3：1
这就是分离比。